香烟烟雾改变粪便中与肠道微生物群相关的代谢物
通过液相色谱法测定烟雾暴露后粪便代谢物的改变，质谱（MS）/ MS分析小鼠粪便。正交偏最小二乘判别分析显示，暴露于烟雾的小鼠的粪便代谢谱与无烟小鼠显着不同（图3A）。与无烟对照小鼠相比，41种代谢物在香烟烟雾暴露小鼠的粪便中改变（图3B）。改变的代谢物在不同的代谢组学信号通路中富集或耗尽（图3C）。与无烟小鼠相比，胆汁酸生物合成是香烟烟雾暴露小鼠中富集途径最高的途径。在肠道中，细菌将原代胆汁酸转化为次级胆汁酸，这些胆汁酸部分被末端回肠和结肠吸收。在这些次级胆汁酸中，已知TDCA是促癌的。TDCA的丰度在烟雾暴露的小鼠中显著增加（图3B）。通过靶向MS进一步证实了香烟烟雾小鼠中粪便TDCA升高（p = 0.0094）（图3D）
图3
图3 注释：香烟烟雾会改变粪便中与肠道微生物群相关的代谢物。（A）OPLS-DA法AOM+吸烟组与AOM组粪便代谢谱存在显著差异，OPLS-DA法为识别不同组间的可辨别模式而进行的监督多元回归分析。x 轴捕获组之间的变异，而 y 轴捕获组内的变异。（B）AOM +吸烟组和AOM组之间的差异代谢物，双尾Mann-Whitney U试验。（C）AOM+吸烟组和AOM组差异代谢物的富集分析。（D）采用靶向质谱法p<0.05，双尾学生t-0-05测定AOM+吸烟组和AOM组粪便中TDCA的浓度。（E）通过部分斯皮尔曼相关性对细菌与差异代谢物进行关联分析。（F）TDCA和Eggerthella lenta之间的线性关联，通过线性模型进行校正和不进行校正（烟雾暴露/无烟雾）。AOM，偶氮甲烷;OPLS-DA，正交偏最小二乘判别分析;TDCA，牛磺酰氧胆酸。
为了确定微生物群与代谢物的潜在关联，通过部分Spearman相关性进行了细菌和代谢物之间的相关性分析。观察到E. lenta与TDCA具有最积极的相关性，而两种益生菌在烟雾暴露的小鼠中耗尽的L. jensenii和L. crispatus与TDCA呈负相关（图3E）。E. lenta具有去除原代胆汁酸的能力，并表达胆汁酸差聚酶3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSDH）;因此，它参与次级胆汁酸合成并影响粪便中TDCA的水平。因此，我们测量了编码3β-HSDH酶的基因的丰度，并且与无烟小鼠相比，观察到烟雾暴露的基因丰度显著更高（补充图3C）。与此相一致，我们进一步证实了E. lenta的丰度与粪便中TDCA的浓度呈正相关（图3F）。因此，肠道微生物生态失调和改变的代谢物可能共同作用，促进结肠肿瘤发生。
补充图3
香烟烟雾损害肠道屏障功能
为了研究吸烟对肠道屏障功能的影响，分析了结肠紧密连接蛋白，claudin-3和Zonula occludens-1（ZO-1）的表达水平以及血清脂多糖（LPS）的水平。香烟烟雾显着降低了通过蛋白质印迹（图4A）和免疫荧光染色（图4B）确定的claudin-3和ZO-1的水平。病理学家在电子显微镜（EM）检查下进一步证实了受损的紧密连接（图4C）。同时，我们发现与无烟小鼠相比，暴露于烟雾的小鼠血清LPS水平显着增加（图4D）。这些结果共同表明，香烟烟雾会导致肠道屏障功能受损。
图4
图4 注释：香烟烟雾会损害肠道屏障功能。（A）通过蛋白质印迹在AOM处理的小鼠结肠中claudin-3和ZO-1的蛋白质表达。（B）通过免疫荧光染色在AOM处理的模型的结肠中claudin-3和ZO-1的蛋白表达。（C）AOM处理的小鼠结直肠肠屏障结构的代表性图像。箭头指向电子显微镜下的细胞-细胞液络部。（a） 紧密连接;（b） 粘附液络部;（c） 脱臀体;（四）间隙结。星号表示细胞连接中断。（D）AOM和AOM+吸烟组小鼠血清中的LPS浓度。数据表示为均值±SD.统计显著性由未配对的学生 t 检验确定。AOM，偶氮甲烷;4′，6-二脒-2-苯基吲哚;LPS，脂多糖。
香烟烟雾增强结肠上皮中致癌的 MAPK/ERK 信号传导
为了获得吸烟的促肿瘤效应的分子见解，使用小鼠癌症通路查找器PCR阵列分析了结肠上皮中癌症相关基因的表达。与无烟对照小鼠相比，我们在烟雾暴露的小鼠中观察到19个上调基因和7个下调基因（图5A，补充表2）。富集分析表明，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是香烟烟雾激活的顶级通路（图5B）。先前的研究报告称，TDCA可以激活MAPK通路的ERK亚家族，26 27因此，与对照小鼠相比，评估了暴露于香烟烟雾的小鼠结肠上皮中的MAPK / ERK激活。通过吸烟激活MAPK / ERK信号传导通过磷酸化ERK1 / 2水平升高来证实，磷酸化ERK1 / 2是MAPK / ERK途径中的关键介质蛋白（图5C）。此外，观察到ERK磷酸化水平与TDCA水平之间存在正相关关系（补充图4A）。这些发现表明，香烟烟雾诱导ERK1 /2磷酸化并激活MAPK / ERK信号通路以促进结肠肿瘤发生。
图5
图5注释：香烟烟雾增强结肠上皮中致癌 MAPK/ERK 通路和促炎通路的表达。（A）通过小鼠癌症通路查找器PCR阵列分析，AOM+吸烟组结肠上皮表达基因与AOM组的差异表达基因（FC=AOM+吸烟/AOM阳性log2（FC）=AOM+吸烟组高表达，阴性log2（FC）=AOM组高表达）。包括AOM+吸烟和AOM>2之间的FC。（B） 富集分析显示，与AOM组相比，AOM+吸烟组的癌症信号通路发生了改变。箭头表示富集的方向，通过比较该途径中上调和下调的基因来计算。MAPK信号通路中的差异表达基因在网络中显示。（C） western blot检测AOM处理小鼠结肠中ρ-ERK1/2的蛋白表达。（D） 通过小鼠炎症反应和自身免疫阵列分析，将AOM+吸烟小鼠结肠上皮的差异表达基因与AOM小鼠进行比较。（E） 富集分析显示，与AOM组相比，AOM+吸烟组的炎症信号通路发生了改变。TNF和IL-17信号通路中的差异表达基因在网络中显示。（F） 定量RT-PCR检测Cxcl2、Il-17a和Il-10的基因表达。统计显著性由双侧非配对Student t检验确定。通过FDR调整p值（补充表2,3）。AOM，偶氮甲烷；ERK，细胞外信号调节蛋白激酶；FC，折叠变化；Il，白细胞介素；MAPK，丝裂原活化蛋白激酶；RT-PCR、逆转录PCR；TNF，肿瘤坏死因子。
补充图4
引文：Cigarette smoke promotes colorectal cancer through modulation of gut microbiota and related metabolites.
