香烟烟雾增强促炎信号基因的表达
肠道细菌生态失调与炎症密切相关，炎症将致癌因素和肿瘤发生联系起来。因此，我们使用小鼠炎症反应和自身免疫PCR阵列分析了促炎基因的表达。与无烟对照小鼠相比，在香烟烟雾暴露的小鼠中观察到27个上调基因和5个下调基因（图5D，补充表3）。香烟烟雾诱导了包括促炎白细胞介素17（IL-17）信号传导和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路在内的改变途径（图5E）。定量逆转录PCR（RT-PCR）证实，与无烟对照小鼠相比，在烟雾暴露的小鼠中，促炎性Il-17a，Cxcl2的表达增加，抗炎Il-10的表达降低（图5F）。此外，Il-17a的相对mRNA表达与结肠中E. lenta的丰度呈正相关（补充图5）。这些发现表明，香烟烟雾会促进结肠肿瘤发生中的炎症。
补充图5
无菌小鼠粪便微生物群移植于烟雾暴露的常规小鼠肠道，微生物群的改变
为了证实香烟烟雾改变肠道微生物群对结直肠肿瘤泌尿素发生的直接作用，我们在无菌小鼠中进行了粪便微生物群移植。无菌小鼠用香烟烟雾暴露或无烟常规小鼠的粪便进行移植。小鼠在20周后进行检查（图6A）。我们进行了霰弹枪宏基因组测序分析，以探索香烟烟雾改变的微生物群的定植。与传统的AOM小鼠模型类似，与香烟无烟小鼠（GF-AOM）的粪便形成大便的小鼠（GF-AOMS）相比，用香烟烟雾暴露小鼠（GF-AOM）的粪便分布的无菌小鼠的α多样性显著降低（图6B和补充图2C）。β多样性分析再次显示这两组无菌小鼠之间的肠道微生物群显着分离（GF-AOMS与GF-AOM，PERMANOVA）（图6C）。进一步的分析显示34个差异丰富的细菌（图6D）。GF-AOMS小鼠中，E. lenta的丰度显著增加，双蚴病菌的丰度显著降低（p<0.05，FC>1.5）。通过定量PCR，我们证实GF-AOMS组中的E. lenta的丰度显著高于GF-AOM组（p<0.001，图6E）。
图6
图6 注释：从烟雾暴露的常规小鼠中通过粪便微生物群移植的无菌小鼠的肠道微生物群的改变。（A）无菌小鼠模型的示意图。无菌小鼠口服AOM+吸烟组和AOM组粪便（n = 8 /组）。在第20周结束时处死小鼠。（B）GF-AOMS和GF-AOM组的Fisher统计（α多样性）和（C）PCoA分析（β多样性）。分别通过双尾曼-惠特尼U检验和PERMANOVA获得了α和β多样性的重要性。（D）GF-AOMS和GF-AOM组之间的差异细菌。通过使用多变量统计模型（（FDR校正），FC>1.5，MaAsLin2）检测丰度差异。（E）通过定量PCR验证了GF-AOMS和GF-AOM组之间Eggerthella lenta物种的丰度。（F） 细菌丰度的一致改变（p<0.05，暴露于烟雾的小鼠与无烟小鼠;GF-AOMS小鼠与GF-AOM小鼠）在两个小鼠模型（无菌小鼠和AOM小鼠）中。计算了吸烟和非吸烟之间的FC丰度。红点代表无菌小鼠模型，黄色点代表常规小鼠模型。（G）与供体相比，在无菌小鼠中强饲法喂养后，网络模块被保守。采用SparCC方法测定相关性，并根据细菌的一阶邻域提取网络模块。（H）通过靶向质谱测定测定GF-AOMS和GF-AOM基团之间粪便中TDCA的浓度，p<0.05，双尾Mann-Whitney U试验。AOM，偶氮甲烷;FC，折叠变化;GF-AOM，无菌小鼠，粪便从AOM供体小鼠中大便;GF-AOMS，用AOM +吸烟供体小鼠的粪便加瓦的无菌小鼠;PCoA，主坐标分析;PERMANOVA，方差的排列多元分析;TDCA，牛磺酰氧胆酸。
进一步测试了两种小鼠模型（无菌小鼠和常规AOM小鼠）之间微生物群改变的一致性。我们发现，与GF-AOM小鼠相比，与无烟AOM小鼠相比，烟雾暴露AOM小鼠中多度的细菌在GF-AOMS小鼠中持续增加，而与GF-AOM小鼠相比，暴露于烟雾的AOM小鼠中丰度降低的细菌在GF-AOMS小鼠中持续减少（图6F）。重要的是，我们观察到E. lenta的丰度增加，而益生菌P. distasonis在烟雾暴露的AOM小鼠和GF-AOMS小鼠中的丰度较低。相关性分析显示，与供体小鼠相比，无菌小鼠粪便移植后生态网络模块是保守的（图6G）。此外，与GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS中的粪便TDCA水平也显着增加（图6H）。
香烟烟雾改变的微生物群增加无菌小鼠的结肠细胞增殖和 tumourigenesis
与GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠的结肠上皮细胞增殖增加，其表现为Ki-67阳性细胞比例更高（图7A）和PCNA表达水平更高（图7B）。此外，我们在无菌小鼠中进行了AOM治疗，并用香烟烟雾暴露（GFAOM-AOMS）或无烟小鼠（GFAOM-AOM）的粪便进行gavag（补充图6A）。与GFAOM-AOM小鼠相比，GFAOM-AOMS小鼠表现出增加的结肠肿瘤数量和肿瘤大小（补充图6B）。这些结果在无菌小鼠中与在常规小鼠中的观察结果一致，因此表明香烟烟雾改变的微生物群和代谢组可以直接促进结肠细胞增殖和 tumourigenesis。
补充图6
图7
图7 注释：香烟烟雾改变的微生物群会增加结肠细胞增殖，肠道屏障功能受损，并增强无菌小鼠中致癌的MAPK / ERK和促炎基因表达。（A）无菌小鼠结肠中Ki67阳性细胞免疫组化染色和Ki67阳性细胞比例的代表性图像。（B）通过蛋白质印迹在无菌小鼠结肠中PCNA的蛋白表达。（C）通过蛋白质印迹在无菌小鼠结肠中claudin-3和ZO-1的蛋白表达。（D）GF-AOM和GF-AOMS组小鼠血清中的LPS浓度。（E）电子显微镜显示无菌小鼠结直肠肠屏障的结构。箭头指向细胞-细胞连接处。（F）通过小鼠癌症通路查找器PCR阵列分析，GF-AOMS组结肠上皮表达基因与GF-AOM组的差异表达基因。（G）通过富集分析与GF-AOM组相比，GF-AOMS组的癌症信号通路改变。包括>1的丰富分数。箭头代表富集方向，通过比较通路中上调和下调的基因来计算。MAPK信号通路中差异表达的基因显示在网络中。（H）通过蛋白质印迹在GF-AOM和GF-AOMS组小鼠结肠中ERK1 / 2的蛋白表达。（I）通过小鼠炎症反应和自身免疫阵列分析，GF-AOMS组结肠上皮表达基因与GF-AOM组的差异表达基因。（J）通过富集分析与GF-AOM相比，GF-AOMS组炎症信号通路的改变。包括>1的丰富分数。TNF和IL-17信号通路中差异表达的基因在网络中显示。（K）通过定量RT-PCR表达Il-17a，Cxcl2和Cxcr2的基因表达。（a） 紧密连接;（b） 粘附液络部;（c） 脱臀体;（四）间隙结。星号表示细胞连接中断。数据表示为平均值±SD. *p<0.05;统计学意义由双尾不成对学生t检验确定。p值由罗斯福调整（在线补充表4，5）。AOM，偶氮甲烷;ERK，细胞外信号调节蛋白激酶;GF-AOM，无菌小鼠，粪便从AOM供体小鼠中大便;GF-AOMS，用AOM +吸烟供体小鼠的粪便加瓦的无菌小鼠;Il，白细胞介素;LPS，脂多糖;MAPK，丝裂原活化的蛋白激酶;PCNA，增殖细胞核抗原;RT-PCR，逆转录PCR;肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子。
香烟烟雾改变的微生物群会损害无菌小鼠的肠道屏障功能
我们研究了香烟烟雾改变的微生物群是否会影响无菌小鼠的肠道屏障功能。观察到GF-AOMS小鼠中claudin-3和ZO-1的表达降低以及血清LPS水平升高（图7C，D）。GF-AOMS小鼠的肠道屏障功能受损也通过EM证实，其显示顶端连接复合物中的细胞间连接和结肠中的细胞旁间隙增宽（图7E）。无菌小鼠的这些结果与常规小鼠一致，因此表明香烟烟雾对微生物群和代谢组的改变可能会损害肠道屏障功能，这可能进一步促进 tumourigenesis。
香烟烟雾改变的微生物群增强无菌小鼠结肠上皮中的致癌MAPK / ERK途径
为了证实香烟烟雾改变微生物群促进结肠细胞增殖的分子机制，我们对粪便无菌小鼠的结肠上皮进行了癌症途径查找器阵列。与GF-AOM小鼠相比，我们在GF-AOMS小鼠中鉴定了9个上调基因和3个下调基因（图7F，补充表4）。这些差异表达基因主要在MAPK/ERK信号通路中富集。与GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠中磷酸化-ERK1 / 2的蛋白表达升高证实了MAPK / ERK信号传导的激活（图7G和H）。此外，我们观察到ERK磷酸化水平与TDCA水平之间存在正相关关系（补充图4B）。同样，使用炎症反应和自身免疫PCR阵列，我们发现与GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS中的16个促炎基因上调（图7I，补充表5），这些基因也主要在TNF和IL-17信号通路中富集（图7J）。通过定量RT-PCR与GF-AOM小鼠相比，TNF和IL-17途径中关键的促炎基因（包括Il-17a和C-X-C基序趋化因子配体2（Cxcl2）和C-X-C基序趋化因子受体2（Cxcr2）的上调在GF-AOMS小鼠中得到证实（图7K）。来自常规和无菌小鼠模型的一致发现表明，通过香烟烟雾改变的微生物群直接诱导结肠促炎性TNF和IL-17信号传导以及致癌MAPK / ERK信号传导。因此，改变的肠道微生物群有助于香烟烟雾在结直肠癌变中的促肿瘤作用。
引文：Cigarette smoke promotes colorectal cancer through modulation of gut microbiota and related metabolites.
