香烟烟雾通过调节肠道微生物群和相关代谢物促进结直肠癌的发生和发展（一）
背景
结直肠癌（CRC）是全球最常见的癌症之一。虽然有许多早期结直肠癌筛查和预防策略，但预计其负担将进一步增加。有证据支持饮食、吸烟、肥胖和运动等生活方式与CRC的关联。吸烟会增加患肺癌的风险，大约80%的原发性肺癌可归因于吸烟。吸烟还会增加其他不直接接触香烟烟雾的器官患癌症的风险，如结肠、直肠、胰腺和肾脏。研究表明，吸烟与人类CRC发病率和死亡显著相关，并且在动物模型中也观察到增加CRC发展的风险。然而，吸烟促进CRC开始和进展的机制尚不清楚。在人类戒烟后观察到细菌多样性增加。报告还表明，微生物组和粘蛋白结构的改变与吸烟有关。此外，来自CRC患者的肠道微生物可以促进受体小鼠的结肠肿瘤发生。然而，肠道微生物群的改变是否代表了吸烟与CRC之间的联系仍然难以捉摸。
在这项研究中，我们旨在使用常规和无菌小鼠模型确定吸烟在CRC开发中的作用。我们证明，吸烟可以通过诱导肠道微生物群生态失调来促进CRC，这会影响代谢物，特别是牛磺脱氧胆酸（TDCA）。增加的肠道TDCA可以激活结肠上皮中致癌的MAPK / ERK（有丝分裂原活化的蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶1/2）途径，然后促进结肠细胞增殖。此外，吸烟可能会损害肠道屏障功能，从而进一步促进TDCA激活结肠致癌MAPK / ERK信号传导。
实验方法
购买雄性10周龄C57BL / 6小鼠。所有小鼠随意给予食物和水，并在特定的无病原体环境中喂养。他们在腹膜内注射致癌物质偶氮甲烷（AOM）（10mg / kg）每周一次，连续 6 周诱导结直肠癌。在AOM注射开始时，小鼠暴露于香烟烟雾（2000 mL / min气流的4%）或每天2小时清洁空气（每组15只小鼠，由四个笼子组成，每个笼子3-4只小鼠）28周。香烟烟雾由蠕动管泵产生。香烟（含有尼古丁）（1.0毫克/支香烟）点燃，用泵连续吸入，与新鲜空气混合，然后泵入吸烟室。只有新鲜空气被泵入清洁室（图1A）。在第28周结束时，香烟烟雾暴露和无烟小鼠都处死。
图1
图1 注释：吸烟会增加小鼠的结直肠致结张力。（A）为香烟烟雾暴露设计的吸烟或清洁室以及AOM诱导的癌症模型的示意图。混合的新鲜空气和烟雾空气被泵入烟室，新鲜空气被泵入清洁室。将小鼠置于腔室中，每天2小时，持续28周。AOM（10mg / kg）每周腹膜内注射一次，从第0天开始连续6周。在第28周结束时处死小鼠（AOM组，n = 15;AOM+吸烟组，n=15）。（B）牺牲时结肠的代表性图像。AOM和AOM+吸烟组小鼠的肿瘤数量和肿瘤大小。（C）AOM组腺瘤的H&E染色和AOM +吸烟组腺癌的代表性图像。（D）AOM治疗小鼠结肠中腺瘤和腺癌的发病率。（E）Ki67阳性细胞免疫组化染色的代表性图像和结肠中Ki67阳性细胞的比例。（F）通过蛋白质印迹在AOM处理的小鼠结肠中PCNA的蛋白表达。AOM，偶氮甲烷;PCNA，增殖细胞核抗原。
实验结果
香烟烟雾促进小鼠结直肠肿瘤发生
为了研究吸烟对结直肠肿瘤发生的影响，将AOM处理的C57BL / 6小鼠暴露于清洁空气或香烟烟雾中（图1A）。在香烟烟雾暴露的小鼠中，结直肠肿瘤数量和肿瘤大小均显著大于无烟对照小鼠（图 1B）。病理学家通过显微镜组织学检查证实了结肠腺瘤和腺癌的存在（图 1C）。暴露于香烟烟雾可显著增加结肠肿瘤的发病率（图 1D）。与无烟对照小鼠相比，观察到香烟烟雾暴露小鼠结肠中上皮细胞的增殖增加，这表明Ki-67阳性细胞的数量显着更高（图1E）和更高的细胞增殖蛋白标记增殖细胞核抗原（PCNA）的表达水平（图1F）。
香烟烟雾改变小鼠肠道微生物群组成和微生物相互作用
由于小鼠在一起生活了很长时间，使用16S测序评估了微生物群落是否存在笼效应。发现笼效应在不同时间点对微生物组群落没有影响（补充图1）。然而，吸烟对微生物群落的显著影响发生在实验结束时（结束时间点）（补充图1），表明长期吸烟是影响微生物群的主要因素。然后，对粪便样品进行鸟枪宏基因组测序分析，以确定由香烟烟雾暴露引起的肠道微生物群的潜在改变。在基线（初始时间点）时，烟雾暴露小鼠和无烟对照小鼠在α和β多样性方面没有显著的微生物组差异（补充图2A，B）。28周后，观察到与无烟对照小鼠相比，香烟烟雾暴露小鼠的α多样性显著降低（图2A和补充图2C）。PCoA分析（β多样性）显示，与无烟对照小鼠相比，暴露于烟雾的小鼠肠道微生物群的聚类显著不同（图 2B）。20个细菌（FC>1.5）在香烟烟雾暴露的小鼠中显著改变（图2C）。其中，E. lenta和头葡萄球菌被富集，而肠道有益细菌，包括罗伊氏乳杆菌，Parabacteroides distasonis and Bacteroides dorei因香烟烟雾暴露而耗尽。通过定量PCR证实了香烟烟雾暴露小鼠中E. lenta的丰度较高;图 2D）。使用我们发布的数据集进一步评估了E. lenta与人类CRC的关联。与正常受试者（n = 204）相比，CRC患者（n = 185）的E. lenta含量显著更高。在这些CRC患者中，吸烟者（n = 30）与非吸烟者（n = 87）相比具有更高的E. lenta丰度（p<0.05）（补充图3A，B）。
补充图1
补充图2
图2
图2 注释：香烟烟雾调节小鼠的肠道微生物群。（A）AOM+吸烟和AOM组的Fisher统计（α多样性）和（B）PCoA分析（β多样性）。分别通过双尾曼-惠特尼U检验和PERMANOVA来获取α和β多样性的重要性。（C）AOM+吸烟组和AOM组的细菌差异化。通过使用多变量统计模型（（FDR校正），FC>1.5，MaAsLin2）检测丰度差异。（D）通过定量PCR验证了AOM+吸烟组和AOM组之间Eggerthella lenta物种的丰度。（E）AOM+吸烟组和AOM组差异细菌之间的生态网络。采用SparCC法测定相关性。选择AOM+吸烟与AOM组>0.6的相关性与相关性强度差异进行可视化。AOM，偶氮甲烷;FC，折叠变化;PCoA，主坐标分析;PERMANOVA，方差的排列多元分析。
微生物之间的相互作用可能有助于疾病进展。我们研究了细菌之间相互作用的生态网络，烟雾暴露的小鼠和无烟对照小鼠之间的丰度差异（图2E）。观察到，暴露于烟雾的小鼠和无烟对照小鼠之间细菌之间的共生和共排除相互作用显著不同。
引文：Cigarette smoke promotes colorectal cancer through modulation of gut microbiota and related metabolites.
仅供学术参考。
益生菌,肠道微生物,肠道微生态制剂,结直肠癌,小鼠实验
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