一线总结！微生物取样、样品制备技巧及稀释、接种、培养方法汇总！
一、样品前处理
（1）无论何种抽样方案,均要求样品有代表性。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。
如果是冷冻样品按要求冷冻保藏，干燥食品可放在常温冷暗处，易腐和冷藏样品应放入10℃环境。冷冻样品来不及检验应放入-15℃以下冰箱内，待检样品存放时间不应超过36h。
（2）样品解冻
如果是冷冻样品，样品取出后，在0-8℃的冰箱中解冻，时间不超过18小时；也可在温度不超过45℃环境中解冻，时间不超过15min。
（3）检测前准备
实验前将工器具移到无菌间，最好用紫外线照射20min分钟灭菌消毒，达到无菌状态。
操作试验的准备物品均质杯、酒精及酒精棉、移液器、灭菌枪头、平皿、稀释液、剪刀、镊子、无菌盆或筐等物品，检查一下是否齐全。
二、检测
1、 样品标识
将样品进行相应标识标记，其中菌落总数按照4789.2操作，每一个稀释度做两个平行，一般做三个稀释度每个样品一摞。
大肠菌群及金黄色葡萄球菌按照4789.3和4789.10中的MPN法检测，每个稀释度3根管，一般也是做3个稀释度。
2、 取样
先将样品外包装正反面用酒精喷洒（如果样品表面有冷凝水先擦拭干净后再用酒精喷洒）
（1）固体样品
① 75%酒精棉消毒开启部位及其周围，再用火焰灭菌的剪刀剪开。
② 在电子称上放上均质杯去皮调整至零。
③ 用火焰灭菌后的剪刀和镊子取样，称取25g有代表性样品。
④ 加入225ml灭菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水（开盖瓶塞时瓶口部和瓶塞应在火焰通过1-2次，以杀灭从空气中落入杂菌）后。
⑤ 擦拭干净剪刀镊子后浸泡于75%酒精容器中。
⑥将均质杯盖上盖子后8000转均质1-2min后作为样液。
（2）液体样品
①冷冻样品完全解冻后使用。
②75%酒精棉消毒开启部位及其周围，再用火焰灭菌的剪刀开启，用灭菌吸管取充分混合后样25ml。
③加入225ml灭菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水混匀作为样液。
(3) 粉末状样品以及半固体样品
①将样品混合均匀。
②75%酒精棉消毒开启部位及其周围，再用火焰灭菌的剪刀开启，以无菌匙采取混合后样10g。
③加入90ml灭菌磷酸盐缓冲液，开盖瓶塞时瓶口部和瓶塞应在火焰通过1-2次，以杀灭从空气中落入杂菌。
④余同上。
三、稀释方法
①从均质杯准确吸取样液1mL混匀的样液，然后沿管壁徐徐接种到含9ml磷酸盐缓冲液里，盖上试管塞后充分震荡混匀为1：100稀释液。（一定要枪头尖端伸入稀释液内2-3mL，以免吸入空气进入移液器，污染样品造成实验失败。）
②重复该操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀释液。
③为减少样品稀释误差，在连续递增稀释时（原液在前稀释液在后），每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一个枪头。
④不要在稀释剂中吹洗吸管。
四、样液接种方法
① 在无菌室，取出灭菌的枪头或者灭菌的移液器
② 准确吸取样品匀液，1mL、1mL、1mL无菌操作分别以2～4s内完全注入已标识清楚的菌落总数平皿、大肠菌群以及金黄色葡萄球菌培养液中
③ 如果某一样品液在接种前放置时间超过3 min，应重新均质
④ 为了验证稀释液、培养基、平皿、枪头等器具无菌需做空白对照
五、倾注培养基
右手持培养基三角瓶（已放45℃的水浴中恒温）置火焰旁边，用左手拇指和食指或中指使平皿开启不超过30°，迅速倒人培养基约15-20ml，加盖后轻轻摇动培养皿，左三圈，右三圈，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面。
六、培养
- 平皿倒置放入恒温培养箱中(每垛最多堆放6个平皿，平皿间要留有空隙进行空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致)，按所规定的时间温度进行培养
- 斜面、高层斜面、液体培养基立在试管架上放入恒温培养箱中，按所规定的时间温度进行培养
七、计数判定及注意事项
- 由于细菌种类繁多，差别甚大。计数时一般用菌落计数器仔细观察。必要时用放大镜检查，以防遗漏尤其是平皿边缘生长的菌落
- 计数方法参照GB 4789.2-2016方法
- 稀释度低的培养皿，微生物菌落和食品碎渣很难区分，一般吸取过滤网过滤后的稀释液以减少食品碎渣的影响
- 为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察
- 必要时，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在平板计数琼脂中加入氯化三苯四氮唑TTC（100ml加入1ml 0.5%TTC），培养后菌落呈红色，易于分别
- 在发酵试验中，发酵倒管的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡，或发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡，都应作进一步试验。如果对产酸但未产气的发酵有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，就像啤酒中的二氧化碳气泡一样，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验
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